ЗАНЯТИЕ № 1
РАЗДЕЛ: ЦИТОЛОГИЯ
ТЕМА : «УСТРОЙСТВО СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ».
Форма организации учебного процесса: практическое занятие.
Место проведения: учебная комната.
Цель занятия: на основании знания устройства светового микроскопа освоить технику микроскопирования и приготовления временных препаратов.
Значимость изучаемой темы
Световая микроскопия – один из объективных методов биологических, медико-биологических и медицинских дисциплинах. Умение правильно пользоваться микроскопом, грамотно оценивать, интерпретировать, документировать (зарисовывать) наблюдаемую микроскопическую картину являются обязательным условием успешного освоения материала на практических занятиях по биологии, гистологии, патологической анатомии, микробиологии.
В результате работы на практическом занятии студент должен
знать:
· устройство светового микроскопа;
· правила работы со световым микроскопом.
уметь:
· работать со световым микроскопом на малом и большом увеличениях;
· готовить временный препарат;
· оформлять зарисовки микроскопических препаратов;
· оформлять протокол занятия.
Оснащение занятия:
Компьютер;
Проектор;
Презентация Power Point по теме;
Световой микроскоп;
Бинокуляр;
Микропрепараты (любые);
Предметные стекла;
Покровные стекла;
Чашки Петри;
Скальпель;
Марлевые салфетки;
Фильтровальная бумага;
Спиртовый раствор йода;
Луковица.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ
РАБОТА № 1. УСТРОЙСТВО СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА.
Задание 1:
- внимательно прочитайте содержание работы № 1 и изучите устройство светового микроскопа.
Рассмотрите основные части микроскопа: механическую, оптическую, осветительную.
К механической части относятся: штатив, предметный столик, тубус, револьвер, макро- и микрометрические винты.
Штатив состоит из массивного подковообразного основания, придающего микроскопу необходимую устойчивость. От середины основания вверх отходит тубусодержатель, изогнутый почти под прямым углом, к нему прикреплен тубус, расположенный наклонно.
На штативе укреплен предметный столик с круглым отверстием в середине. На столик помещают рассматриваемый объект (отсюда название «предметный»). На столике имеются два зажима, или клеммы, неподвижно фиксирующие препарат. По бокам столика расположены два винта – препаратовыделители, при вращении которых столик передвигаются вместе с объективом в горизонтальной плоскости. Через отверстие в середине столика проходит пучок света, позволяющий рассматривать объект в проходящем свете.
На боковых сторонах штатива, ниже предметного столика, найдите два винта, служащие для передвижения тубуса. Макрометрический винт, или кремальера, имеет большой диск и при вращении поднимает или опускает тубус для ориентировочной наводки на фокус. Микрометрический винт, имеющий наружный диск меньшего диаметра, при вращении перемещает тубус незначительно и служит для точной наводки на фокус. Вращать микрометрический винт можно только на полоборота в обе стороны.
Оптическая часть микроскопа представлена окулярами и объективами.
Окуляр (от лат. oculus - глаз) находится в верхней части тубуса и обращен к глазу. Окуляр представляет собой систему линз, заключенных в металлическую гильзу цилиндрической формы. По цифре на верхней поверхности окуляра можно судить о кратности его увеличения (Х 7, Х 10, Х 15). Окуляр можно вынимать из тубуса и заменять по мере надобности другим.
На противоположной стороне найдите вращающуюся пластинку, или револьвер (от лат. revolvo - вращаю), в которой имеется 3 гнезда для объективов. Как и окуляр, объектив представляет собой систему линз, заключенных в общую металлическую оправу. Объектив ввинчивается в гнездо револьвера. Объективы также имеют различную кратность увеличения, которая обозначается цифрой на его боковой поверхности. Различают: объектив малого увеличения (Х 8), объектив большого увеличения (Х 40) и имерсионный объектив, используемый для изучения наиболее мелких объектов (Х 90).
Общее увеличение микроскопа равно увеличению окуляра, умноженному на увеличение объектива. Таким образом, световой микроскоп имеет максимальную кратность увеличения 15 Х 90 или может максимально увеличивать в 1350 раз.
Осветительная часть микроскопа состоит из зеркала, конденсора и диафрагмы.
Зеркало укреплено на штативе ниже предметного столика и благодаря подвижному креплению его можно вращать в любом направлении. Это дает возможность использовать источники света, расположенные в различных направлениях по отношению к микроскопу, и направлять пучок света на объект через отверстие в предметном столике. Зеркало имеет две поверхности: вогнутую и плоскую. Вогнутая поверхность сильнее концентрирует световые лучи и поэтому используется при более слабом, искусственном освещении.
Конденсор находится между зеркалом и предметным столиком, он состоит двух-трех линз, заключенных в общую оправу. Пучок света, отбрасываемый зеркалом, проходит через систему линз конденсора. Меняя положение конденсора (выше, ниже), можно изменить интенсивность освещенности объекта. Для перемещения конденсора служит винт, расположенный кпереди от макро и микровинтов. При опускании конденсора освещенность уменьшается, при поднимании – увеличивается. Диафрагма, вмонтированная в нижнюю часть конденсора, также служит для регуляции освещения. Эта диафрагма состоит из ряда пластинок, расположенных по кругу и частично перекрывающих друг друга таким образом, что в центре остается отверстие для прохождения светового пучка. С помощью специальной ручки, расположенной на конденсоре с правой стороны, можно менять положение пластинок диафрагмы относительно друг друга и таким образом уменьшать или увеличивать отверстие и, следовательно, регулировать освещенность.
Задание 2:
- изучив содержание работы № 1 и рисунок 1, в рабочей тетради правильно обозначьте соответствующие детали микроскопа цифрами от 1 до 11.
Задание 3:
- в рабочей тетради письменно дайте ответы на вопросы для самоконтроля.
Вопросы для самоконтроля:
- Какие детали светового микроскопа относятся к механической части?
- Какие детали светового микроскопа относятся к оптической части?
- Какие детали светового микроскопа относятся к осветительной части?
- Укажите, какой кратности увеличения могут быть объективы?
- Укажите, какой кратности увеличения могут быть окуляры?
- Как называется объектив, кратностью увеличения х90?
- Какую кратность увеличения имеет объектив «большого» увеличения?
- Как можно найти общую кратность увеличения микроскопа?
- Какую роль выполняет конденсор?
- Для чего нужна диафрагма?
- В каких случаях используется вогнутая поверхность зеркала?
РАБОТА № 2. ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ И ПРАВИЛА РАБОТЫ С МИКРОСКОПОМ.
Задание 1:
- внимательно прочитайте содержание работы № 2;
- законспектируйте технику микроскопирования и правила работы с микроскопом в рабочую тетрадь.
1. Установить микроскоп у края стола против левого плеча. С правой стороны расположить открытый альбом для практических занятий. Протереть окуляр марлевой салфеткой. Обратить зеркало микроскопа вогнутой стороной к источнику света.
2. Привести микроскоп в рабочее состояние:
· установить объектив малого увеличения на расстоянии 1-1,5 см от предметного столика;
· поднять конденсор до предела;
· смотря в окуляр одним глазом, не закрывая другого, равномерно и интенсивно осветить зеркалом поле зрения;
3. Поместить препарат на предметный столик микроскопа покровным стеклом кверху (обратить на это внимание). Передвигать препарат большим и указательным пальцами за ребро с тем, чтобы найти место, подлежащее изучению; средний палец должен упираться в предметный столик.
4. Опустить конденсор до положения, обеспечивающего наилучшее освещение препарата на малом увеличении.
5. Рассмотреть препарат с помощью 8- или 10-кратного объектива (малого увеличения). Найти место, подходящее для изучения при большом увеличении, поставить его в центр поля зрения и отрегулировать резкость изображения микровинтом.
6. При переходе с малого увеличения на большое необходимо, не меняя фокусного расстояния, повернуть револьверную пластинку объективов до щелчка, чтобы в рабочее положение встал 40-кратный объектив (большого увеличения). Микровинтом добиться резкого изображения. Работа макровинтом на большом увеличении запрещается, так как легко можно раздавить препарат.
7. Левая рука должна находиться на микрометрическом винте, слегка поворачивая его в обе стороны для просматривания деталей среза, лежащих на разной глубине поверхности среза.
8. Уяснив пространственное положение, пропорции и взаимоотношения деталей изучаемого объекта, приступить к зарисовке.
9. Запрещается снимать препарат из под объектива большого увеличения. Для того, чтобы убрать препарат с предметного столика микроскопа в рабочее положение ставится объектив малого увеличения и препарат снимается с предметного столика микроскопа.
10. Запрещается развинчивать какие-либо части микроскопа. В случае неисправности микроскопа обращаться к преподавателю .
Задание 2:
· подготовьте микроскоп к работе, по вышеизложенным правилам работы с микроскопом под пунктами 1-2;
· получите микропрепарат (любой) у преподавателя;
· получите резкое изображение сначала на малом, а затем на большом увеличении микроскопа согласно пунктам 3-7 правил работы с микроскопом;
· рассмотрев микропрепарат, правильно снимите его с микроскопа, согласно пункту 9 правил работы с микроскопом.
РАБОТА № 3. ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВРЕМЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Задание 1:
- внимательно прочитайте содержание работы № 3;
- приготовьте временный препарат.
Возьмите предметное стекло из чашки Петри, держа его за боковые грани, и положите на стол. Отделите от кусочка луковицы мясистую чешуйку. На внутренней ее стороне находится тонкая пленка. Снимите ее пинцетом и отрежьте кусочек пленки размером несколько квадратных миллиметров. Положите этот кусочек на предметное стекло, наберите пипеткой раствор йода, капните каплю йода на пленку и накройте покровным стеклом (обязательно держа его за боковые грани, чтобы не оставить следов от пальцев).
Задание 2:
· ознакомьтесь с нижеизложенным описанием микроскопической картины временного препарата;
· получите изображение временного препарата на малом увеличении и рассмотрите его;
· получите изображение временного препарата на большом увеличении и рассмотрите его.
Рассмотрите препарат на малом увеличении. На препарате видна группа клеток, имеющих вытянутую, почти прямоугольную форму. Крупные округло-овальные ядра в клетках окрашены йодом в желто-коричневый цвет. Переведите объектив на большое увеличение и найдите двухконтурную оболочку клетки. Обратите внимание на её толщину. При внимательном рассмотрении цитоплазмы клетки видна ее зернистая структура. Ядро обычно занимает срединное положение в клетке. Иногда оно смещено к оболочке и приобретает сплющенную форму. В ядре можно заметить 1-2 ядрышка. Неокрашенные пустоты в цитоплазме клеток представляют собой вакуоли.
Задание 3:
· в рабочей тетради выполните зарисовку микроскопической картины временного препарата клеток кожицы лука, предварительно ознакомившись с образцом зарисовки и содержанием работы № 4.
Зарисуйте несколько клеток. На рисунке должны быть обозначены: 1) ядро 2) цитоплазма; 3) двухконтурная оболочка.
ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ЗАРИСОВКИ:
Препарат: Кожица лука.
Непременным условием получения отчетливого, резкого и ясного изображения микроскопируемого объекта является, как уже сказано, правильная установка освещения, а также правильный подбор окуляров и объективов.
Для установления правильного освещения: при работе с дневным светом открывают ирис-диафрагму, поднимают конденсор до уровня предметного столика и улавливают при малом увеличении плоской стороной зеркала лучшую освещенность поля зрения микроскопа; при искусственном освещении конденсор опускают настолько, чтобы изображение источника света находилось в плоскости препарата и было отчетливо видно в микроскоп.
При микроскопировании неокрашенных препаратов конденсор устанавливают, как выше описано, а ирис-диафрагму несколько суживают. Излишнюю яркость поля зрения можно ослабить также регулированием силы света лампочки осветителя, перемещая ручку реостата трансформатора и применяя светофильтр, либо опусканием конденсора. Следует помнить, что чем выше поднят конденсор, тем ярче будет освещено поле зрения микроскопа. Окрашенные препараты обычно рассматривают с иммерсионным объективом. Конденсор при этом должен быть поднят до предела, так как при микроскопировании с иммерсионной системой требуется особенно сильное освещение.
Для рассматривания препаратов при различных увеличениях пользуются разными сочетаниями окуляров и объективов. Выбор нужного увеличения определяется микроскопируемым объектом, целями исследования и разрешающей силой микроскопа. Под разрешающей силой микроскопа понимают то наименьшее расстояние между двумя точками препарата, изображение которых можно отчетливо различить при микроскопировании. Чем меньше это расстояние, тем больше разрешающая сила микроскопа. Предел разрешающей способности оптического микроскопа - 0,2 мкм - половина длины волны видимого спектра. Обусловлен он волновой природой света. Чем больше кривизна линз объектива (чем он сильнее), тем более мелкие объекты можно в этот объектив рассмотреть.
Объективы сухой системы имеют меньшую разрешающую способность, чем иммерсионные. Так, объектив с собственным увеличением 40Х дает возможность рассмотреть объекты размером не менее 0,85 мкм. Иммерсионный объектив 90X обычного биологического микроскопа позволяет увидеть объекты размером 0,45 мкм. У лучших современных оптических микроскопов, разрешающая способность иммерсионных объектов доведена до предела. Окуляры не открывают новых деталей в строении микробных клеток: они, увеличивая полученное от объектива изображение, дают возможность увидеть препарат тем крупнее, чем сильнее окуляр. Поэтому при микроскопировании дрожжевых клеток и плесневых грибов (как достаточно крупных объектов) можно пользоваться объективом 40 X. Для изучения бактерий следует применять иммерсионный объектив 90Х. Окуляры в обоих случаях можно использовать любые.
Процесс микроскопирования начинают с того, что на предметный столик микроскопа помещают приготовленный препарат и зажимают его клеммами. Наблюдая сбоку (глаза должны находиться на уровне предметного столика), опускают макрометрическим винтом (кремальерой) тубус микроскопа почти до соприкосновения объектива с покровным стеклом, а иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенную на высушенный окрашенный препарат.
Нельзя опускать объектив чрезмерно низко, а тем более давить им на стекло, так как при этом можно не только раздавить покровное (и даже предметное!) стекло, но и повредить фронтальную линзу объектива. В последнем случае объектив выбывает из строя. Особенно осторожно нужно опускать тубус микроскопа при работе с иммерсионным объективом, так как свободное рабочее пространство этого объектива составляет всего 0,15 мм.
После того как тубус будет опущен, смотря в окуляр, начинают медленно вращать макрометрический винт «на себя», до появления в поле зрения микроскопа контуров объекта (грубая наводка). Наиболее четкого и резкого изображения (фокусировки микроскопа) добиваются вращением микрометрического винта. Однако вращать микрометрический винт более чем на один-два полных оборота в ту или другую сторону не рекомендуется.
Если при вращении кремальеры изображение оказалось «пропущенным», нельзя, глядя в окуляр, быстро обратным вращением опускать тубус микроскопа вниз, так как можно раздавить предметное стекло и испортить объектив. В этом случае опять, смотря сбоку, нужно установить объектив в исходное положение и операцию фокусировки повторить сначала.
После работы иммерсионное масло с объектива удаляют чистой тряпочкой, фронтальную линзу объектива протирают маленьким ватным тампоном, слегка смоченным спиртом (пользуются и авиационным бензином), и вновь протирают сухой чистой тряпочкой. Удалять кедровое масло с объектива нужно легко, без давления. Хранить микроскоп следует в футляре либо закрывать его чехлом или стеклянным колпаком для предохранения от пыли.
1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами.
2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х.
3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы.
4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом.
5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения (8х) на объективы большего увеличения (40х,90х).
а) При работе со средним увеличением (объектив 40х) диафрагму конденсора слегка приоткрывают, чтобы усилить освещение. Фокусируют при помощи микрометрического винта.
б) При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхность стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанавливают микрометрическим винтом.
Изучаемые объекты, как правило, принято зарисовывать. Для этого препарат помещается в поле зрения микроскопа в положении наиболее удобном для зарисовки, что достигается передвижением предметного столика. Зарисовка производится по возможности точно в отношении размера, формы, расположения клеток бактерий, дрожжей, органов спороношения мицелиальных грибов и т.д.
Правила обращения с микроскопом
1. Микроскоп следует оберегать от пыли, т.е. хранить в футляре или под колпаком.
2. Нельзя оставлять микроскоп на солнце или около зажженой горелки, т.к. может расплавиться канадский бальзам, которым склеены линзы в объективах.
3. Окончив просмотр препарата, сначала поднимают тубус, а затем снимают со столика препарат.
4. По окончании работы с микроскопом, подняв тубус и поставив объектив в удобное положение, осторожно, протирают его фронтальную линзу при помощи чистой мягкой хлопчатобумажной ткани или специальной фланели.
5. Особое внимание обращают на иммерсионный объектив, масло с поверхности которого удаляют указанной тканью, смоченной очищенным бензином или спиртом.
Нельзя допускать присыхания масла на объективе .
6. Особенно бережно необходимо относиться:
а) к микрометрическому винту - не делать полных оборотов.
б) к иммерсионному объективу, т. к. из-за короткого фокусного расстояния его фронтальной линзы, легко можно раздавить предметное стекло с препаратом, что может привести к появлению царапин на линзе.
Бактерии объединяют обширную группу в основном одноклеточных микроорганизмов, различающихся по форме, размерам, взаимному расположению клеток, наличию или отсутствию спор, жгутиков, капсул и т. д. (Рис. 3,4).
Для определения группы или вида бактерий, прежде всего, изучают их морфологические признаки: формы и сочетания клеток, их размеры, подвижность, способность к спорообразованию, отношение к окраске по Граму, наличие капсул и клеточных включений. Изучение морфологических признаков бактерий осуществляется обычно с помощью оптического микроскопа.
Рис. 3. Основные формы бактерий:
1-стафилококки; 2-3-диплококки; 4-стептококки; 5-тетракокки; 6-сарацины; 7-9-различные виды палочек.
Рис. 4. капсулы, споры и жгутики бактерий:
а-капсулы; б-форма и расположение спор; в-монотрихи; г-лофотрихи;
д-перитрихи.
Для изучения бактерий под микроскопом готовят препараты на предметном стекле. Предметные стекла – это пластинки из тонкого стекла (76х26 мм) с хорошо отшлифованными краями. Сверху препарат закрывается покровным стеклом. Их размеры – 18x18, 20x20 мм и др. Все стекла (предметные и покровные) должны быть совершенно чистыми и обезжиренными. Стекла считаются чистыми в том случае, если вода легко расплывается на поверхности стекла, не образуя капель шаровидной формы.
Очистка новых стекол производится в течение 10 минут в 1% растворе соды с последующей промывкой дистиллированной водой, затем слабой соляной кислотой и вновь дистиллированной водой. Стекла бывшие в употреблении, выдерживаются и концентрированной серной кислоте, промываются водой, кипятятся в 2% растворе соды в течение 10 минут, после чего тщательно промываются дистиллированной водой.
Обезжиренные стекла хранят в закрытой чистой коробке и при употреблении следует их брать так, чтобы не прикасаться к их поверхности.
Микроскопирование бактерий можно проводить, рассматривая их как в живом состоянии, так и в мертвом, в специально приготовленных окрашенных препаратах. Последние весьма широко используются в практике, т.к. вследствие слишком малых размеров клеток бактерий, в живом состоянии не удается рассмотреть некоторые детали их строения, (оболочка, включения, наличие спор), в то время как они более четко выявляются при окрашивании мертвых клеток специальными красками.
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют световые микроскопы разных моделей («МБИ-1», «Биолам», «Бимам», «Микмед»). Для изучения более мелких объектов (вирусов) используют электронные микроскопы.
Все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы. Механическая часть состоит из основания штатива (1), предметного столика (2), тубусодержателя (3), револьвера объектива (4), макровинта (5) - для перемещения тубуса, микровинта (6) – для тонкой фокусировки. Оптическая часть микроскопа состоит из объективов (7), окуляров (8) и осветительного устройства (9). Объективы представляют собой систему линз, одна из которых производит увеличение, а все остальные корригируют изображение. Окуляры состоят из двух линз (собирающей и глазной). Они увеличивают изображение, получаемое с помощью объектива. Осветительное устройство (зеркало, ирис-диафрагма и конденсор).
1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами.
2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х.
3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы.
4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом.
5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения на объективы большого увеличения (40х, 90х).
6. При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхностью стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанвливают микрометрическим винтом.
При микроскопии в темном поле лучи, освещающие объект не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся. Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора.
С помощью фазово-контрастной микроскопии могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты. Для работы по методу фазового контраста, нужно кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Для этого конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует светопольному конденсору.
Современный микроскоп – это точный оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Хранить микроскоп нужно закрытым от пыли (под чехлом или под специальным стеклянным колпаком). Время от времени следует проверять чистоту и состояние оптики и протирать ее только снаружи с помощью волосяной кисточки или мягкой ткани, смоченной спиртом. Раз в год микроскоп должен просмотреть и при необходимости отремонтировать мастер-оптик.
Микроскопическая техника - это комплекс приемов и правил обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными частями.
При работе с микроскопом прежде всего необходимо оберегать его от загрязнений (в промежутках между работой его накрывают стеклянным или картонным колпаком). Не рекомендуется часто вывинчивать объективы: срабатывается резьба и нарушается их центровка. Оптическую часть тщательно протирают много раз стиранной незагрязненной батистовой или полотняной тряпочкой, следы грязи удаляют тампоном, смоченным 95% спиртом, а затем протирают сухим тампоном. Масло снимают с поверхности линзы сухой мягкой тряпкой, а его остатки можно удалять ксилолом. С механической части прибора удаляют . Сложная чистка и смазка производится специалистом.
Работа с современными микроскопами требует применения рационального освещения, тщательного выбора оптической системы «объектив - окуляр - конденсор», а также предметных и покровных стекол необходимого качества, соответствующей подготовки препарата - объекта исследования. В качестве точечных источников света служат осветители ОИ-7, ОИ-9, ОИ-18, ОИ-19, снабженные коллекторной линзой. Осветитель устанавливают на расстоянии 30-40 см перед микроскопом. Не следует слишком ярко освещать , так как это снижает качество изображения. Установив освещение, регулируют угловую апертуру конденсора, открыв полностью апертурную диафрагму и закрыв полностью диафрагму поля (коллектора), наблюдают в микроскоп светящийся кружок (отверстие диафрагмы). Затем постепенно суживают апертурную диафрагму до момента, когда в поле зрения будет видно пятно без голубой или зеленой каймы. Качество изображения зависит от рационального применения объективов и окуляров. Пользуясь различными сочетаниями объективов и окуляров, можно получить различные увеличения. Однако выбор нужного увеличения должен определяться прежде всего объектом, целями исследования и разрешающей способностью микроскопа.
При бактериоскопии, как правило, применяются иммерсионные объективы (масляный, водный, глицериновый). Для получения хорошего изображения без применения покровного стекла рекомендуется употреблять специальное иммерсионное масло, каплю которого наносят на мазок, расположенный на предметном стекле. При работе с иммерсионным объективом нужно очень осторожно опускать тубус, чтобы не повредить фронтальную линзу объектива. Качество изображения зависит и от толщины предметного стекла (не больше 1,1-1,4 мм) и покровного стеклышка (не толще 0,15-0,17 мм).
Вспомогательными приборами при микроскопии служат: нагревательный столик, окуляр-микрометр, объект-микрометр, рисовальный аппарат и микроманипулятор.
Нагревательный столик устанавливается вместо предметного стола. Степень нагрева регулируется терморегулятором. Препарат на таком столике устанавливается, как и на обычном предметном столике микроскопа.
Окуляр-микрометр дает возможность измерения наблюдаемых объектов. С этой целью фокусируют объектив на шкале объект-микрометра, каждое деление которого равно 10 мк.
Важным разделом микроскопической техники является зарисовка объекта исследования. Рисунок можно сделать визуально или более точно при помощи рисовального аппарата. При визуальном методе в микроскоп смотрят левым глазом, а правым следят за движением карандаша на бумаге. Рисовальный аппарат насаживается на тубус микроскопа. Зеркало отбрасывает через призму изображение бумаги и карандаша, рисующего в плоскости глазной точки окуляра, в глаз, поэтому наблюдатель одновременно видит объект, бумагу и кончик карандаша.
Микроманипулятор позволяет осуществлять тонкие и точные движения микроинструментов и выполнять в поле микроскопа некоторые операции на клетке (удаление и ядер, инъекции различных веществ, отрезание различных участков и т. д.). Он состоит из системы штативов, снабженных винтами, зажимающими микроинструменты, что обеспечивает движение микроинструментов во всех направлениях.
Живые объекты () помещают на предметное стекло в каплю наиболее подходящей для них среды (можно изотонический раствор хлорида натрия) и, накрыв покровным стеклом (), рассматривают в проходящем свете в светлом или темном поле. Фиксированные и окрашенные препараты бактерий изготовляют в виде мазков или отпечатков (см. Окраска микроорганизмов).
Микроскопирование препаратов - см. Микроскопия. См. также Микроскоп.
Микроскопическая техника - правила обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными приборами.
Важное условие успеха микроскопирования - установка освещения. Только при оптимальном освещении по Келеру (рис. 1) можно реализовать все возможности микроскопа. Чтобы установить освещение по Келеру, необходимо иметь стандартный осветитель типа ОИ-7 (рис. 2) или ОИ-19 с микролампой (с небольшой, плотно скрученной спиралью), которую можно передвигать вдоль оси осветителя. При этом свет микролампы фокусируется линзой-коллектором, и на некотором расстоянии от осветителя возникает резкое изображение спирали лампы. Площадь линзы ограничивается ирис-диафрагмой переменной величины. Резкое изображение спирали лампы направляют через зеркало микроскопа на закрытую до отказа диафрагму конденсора, представляющего светосильную короткофокусную систему линз, которая собирает весь входящий в нее световой поток на очень малый участок объекта. Весь осветитель перемещают по столу до тех пор, пока изображение спирали лампы не покроет всю диафрагму конденсора. Этот момент замечают, глядя спереди на плоское зеркало микроскопа, в котором отражается диафрагма конденсора. Если нужно, лампу в осветителе передвигают вдоль оси, пока изображение спирали не достигнет нужной величины, после чего полностью открывают диафрагму конденсора.
Рис. 1. Схематическое изображение хода лучей при освещении препарата по методу Келера: 1 - нить лампы; 2 - коллектор; 3 - диафрагма поля; 4 - изображение нити лампы в плоскости апертурной диафрагмы; 5 - апертурная диафрагма; в - конденсор; 7 - изображение краев диафрагмы поля в плоскости препарата.
Рис. 2. Микроскоп МВИ-1 с осветителем ОИ-7.
Затем на предметный столик микроскопа ставят препарат и фокусируют на нем тот объектив, с которым собираются работать.
Глядя в окуляр, движением плоского зеркала добиваются наилучшего в этих условиях освещения. Затем закрывают до упора диафрагму осветителя. Если при этом ее изображение уходит из поля зрения, его нужно вернуть движением зеркала. Поднимая или опуская конденсор, стараются сделать изображение диафрагмы осветителя резким. Этим определяется оптимальная высота конденсора при его взаимодействии с данным объективом (при работе с объективами малых увеличений приходится отвинчивать верхнюю линзу конденсора, чтобы согласовать его работу с возможностями объектива). При смене объектива изображение закрытой диафрагмы осветителя следует снова сфокусировать в фокальной плоскости объектива.
Движением зеркала изображение диафрагмы осветителя переводят в центр поля зрения. Если края изображения окрашены неодинаково (один полюс синеватый, другой - красноватый), это значит, что ось осветителя наклонена к вертикальной плоскости микроскопа. Наблюдая через окуляр, перемещают осветитель вручную так, чтобы окраска краев изображения стала одинаковой по всей его окружности. Освещенность поля зрения становится равномерной по всей площади. Остается раскрыть диафрагму осветителя настолько, чтобы ее изображение точно вписалось в поле зрения данного объектива. Световой поток будет при этом использоваться полностью и не возникнет избыточных световых пучков, которые могут породить помехи в изображении. Теперь при помощи реостата, изменяющего питание осветителя, устанавливают такой накал лампы, при котором глаз не утомляется излишней яркостью и без труда различает мельчайшие детали.
Установка освещения по Келеру - обязательное условие квалифицированной работы с микроскопом. Нарушение правильного освещения неизбежно ведет к потере разрешения и контраста, к оптическим ошибкам, особенно при микрофотографии и микрокиносъемке.
К современным микроскопам придаются различные приспособления для автоматической и полуавтоматической установки освещения. Их использование облегчает установку освещения, но не отменяет метода Келера. На базе стандартного освещения по Келеру, проделав некоторые дополнительные операции, налаживают работу всех остальных видов микроскопов. Так, например, для перехода к темнопольной микроскопии нужно после установки стандартного освещения заменить обычный конденсор темнопольным (не меняя положения остальных узлов микроскопа) и, наблюдая в окуляр, медленно поднимать его до тех пор, пока не возникнет темнопольное изображение - сверкающие частицы объекта на почти черном фоне. Предметное стекло для темнопольной микроскопии должно иметь толщину 1 -1,2 мм, иначе конденсором нельзя сфокусировать свет на объекте.
Переход к фазово-контрастной микроскопии несколько сложнее. Конденсор фазово-контрастного устройства имеет в фокальной плоскости барабан с набором кольцевых диафрагм разного размера (см. рис. 2 в ст. «Микроскопия»), Цифры, появляющиеся в окне барабана при его повороте, показывают, каким объективом (х10, х20, х40 или х90) следует пользоваться при диафрагме, величина которой видна в окне в данный момент; цифра О означает отсутствие диафрагмы (работа конденсора в обычном режиме). В этом положении устанавливают стандартное освещение. Затем фокусируют на препарате намеченный к работе объектив.
Изображение, как правило, видно очень плохо, но нужно добиться его фокусировки. Поворотом барабана устанавливают нужную кольцевую диафрагму. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп, имеющийся в комплекте фазово-контрастного устройства. Он облегчает рассмотрение зоны, где формируется изображение.
Перемещая окуляр этого микроскопа, добиваются резкой видимости двух колечек различной плотности, расположенных в глубине тубуса микроскопа. Одно из них образовано кольцевой щелью в диафрагме конденсора; другое представляет собой так называемую фазовую пластинку - полупрозрачное колечко из специального покрытия, нанесенное на одну из линз объектива. Изображения этих колечек, как правило, не совпадают друг с другом. Движением центрирующих винтов, расположенных под барабаном, перемещают диафрагму так, чтобы ее изображение полностью совпало с фазовой пластинкой. После этого заменяют вспомогательный микроскоп обычным окуляром и начинают наблюдение фазово-контрастированного изображения.
Примерно такими же приемами можно получить амплитудное контрастирование в микроскопах амплитудно-контрастного (аноптрального) типа.
После смены препарата следует проверить, сохранились ли условия освещения, так как толщина предметных стекол колеблется и плоскость объекта может не совпасть с ранее установленной плоскостью фокуса конденсора. Для проверки нужно закрыть диафрагму осветителя. Если ее изображение при объективе, сфокусированном на новом препарате, окажется нерезким, нужно изменить высоту конденсора, после чего снова открыть диафрагму до размера поля зрения.
Микроскопирование лучше вести при помощи бинокулярной насадки; она распределяет световую нагрузку на оба глаза, которые в результате меньше утомляются при длительной работе.
Несмотря на значительные успехи микрофотографии и микрокиносъемки за последние годы, рисовальные аппараты остаются весьма полезными при работе с толстыми, многоплановыми объектами, которые невозможно сфотографировать из-за большой глубины. Промышленность выпускает рисовальный аппарат РА-4, пользование которым не вызывает затруднений. Аппаратура для микрофотосъемки (микро-фотонасадка МФН и др.) проста, доступна и удобна в обращении. Однако получение высококачественных микрофотографий требует большой практики.
Окончив работу с микроскопом, нужно прикрыть его от пыли. Если использовали иммерсионный объектив, кедровое масло нужно осторожно стереть чистой ладонью и отмыть его следы с фронтальной линзы объектива чистой тряпочкой, слегка увлажненной бензином или ксилолом (обильно смачивать нельзя, так как эти вещества могут растворить клей, скрепляющий линзы объектива).
Правила ухода за микроскопом описаны в инструкции к нему.
Бактериоскопия - это исследование бактерий при помощи светового микроскопа - широко применяется в медицинской практике. Бактериоскопическому исследованию (см. Бактериологическое исследование) подвергают фиксированные окрашенные препараты, а также бактерии в живом состоянии в препаратах «висячая» или «раздавленная» капли (см. Висячая капля, Раздавленная капля).
Изготовление микроскопических препаратов - см. Бактериологическая техника. Бактериологическое исследование, Вирусологические исследования, Гистологическая техника. К любому микроскопическому препарату предъявляется одно общее требование: толщина предметного стекла не должна превышать 1,2-1,4 мм, покровного - 0,4 мм.
Загрузка...